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     本項目是河雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)是世界上栽培最廣泛、生產(chǎn)量和消費量最大的食用菌。自雙孢蘑菇人工栽培伊始，人們就發(fā)現(xiàn)栽培雙孢蘑菇時必須覆土，否則很少或不能出菇。覆土對雙孢蘑菇生產(chǎn)發(fā)展造成了嚴重影響。首先，由于需要覆蓋3.0 cm左右的覆土，降低了培養(yǎng)料厚度和單位面積床層的產(chǎn)量；第二，覆土極易招致病蟲危害，如在我國普遍發(fā)生的蘑菇疣孢霉病，輕者減產(chǎn)1-2成，重者甚至絕收，其病原菌主要來自土壤；第三，菇表帶土，影響鮮售和加工；第四，覆土不能重復(fù)利用，覆土來源越來越少，不利于雙孢蘑菇的可持續(xù)發(fā)展；第五，很多菇農(nóng)需要到外地購買土壤，再經(jīng)消毒、覆土，使雙孢蘑菇生產(chǎn)成本增加近1/3。因此，揭開雙孢蘑菇覆土出菇機理，從而在栽培時不覆土或使用替代材料，對雙孢蘑菇生產(chǎn)非常重要，也非常迫切。在河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目的支持下進行了研究，主要研究結(jié)果如下： （1）闡明了雙孢蘑菇乙烯生物合成途徑研究 從雙孢蘑菇菌絲和培養(yǎng)基中均能檢測到1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）。ACC合酶（ACS）和ACC氧化酶（ACO）是植物ACC乙烯生物合成途徑的關(guān)鍵酶，該二種酶的活性在雙孢蘑菇菌絲中也均可檢測到。高等植物ACS 和ACO 抑制劑氨基氧乙酸(aminooxyacetic acid，AOA) and CoCl2 顯著降低雙孢蘑菇該二種酶的活性。從雙孢蘑菇菌絲中克隆測序了二個ACS基因和一個ACO基因。構(gòu)建的雙孢蘑菇的反義ACO基因的轉(zhuǎn)化子和ACO-RNAi 轉(zhuǎn)化子的ACO基因的表達量、ACO酶活性和乙烯合成量均顯著降低。構(gòu)建的轉(zhuǎn)ACC脫氨酶基因（AcdS）的轉(zhuǎn)化子的ACC含量和乙烯產(chǎn)量顯著減少。證實了雙孢蘑菇的乙烯合成途徑是ACC途徑，和高等植物相同。 （2）揭示了雙孢蘑菇覆土出菇的機理 在雙胞蘑菇覆土中大量存在AcdS產(chǎn)生菌，占可培養(yǎng)細菌的20%左右。將AcdS產(chǎn)生菌惡臭假單胞菌UW4和雙胞蘑菇共培養(yǎng)，UW4能夠吸附到雙胞蘑菇菌絲體上，顯著提高菌絲的生長速度，顯著降低菌絲乙烯產(chǎn)量。添加UW4到滅菌的覆土或蛭石中，能夠顯著提高雙胞蘑菇子實體的形成數(shù)量。而其AcdS敲除突變株UW4-AcdS-則起到與之相反的作用。構(gòu)建的雙孢蘑菇反義ACC氧化酶基因工程菌株或轉(zhuǎn)ACC脫氨酶基因的工程菌株，覆以滅菌材料，能夠正常出菇，雙孢蘑菇出發(fā)菌株則不能出菇。因此，雙孢蘑菇覆土出菇的機理是，覆土中的ACC脫氨酶產(chǎn)生菌降解雙孢蘑菇菌絲產(chǎn)生的ACC，減少了雙孢蘑菇乙烯的合成，解除了自抑物質(zhì)乙烯對出菇的抑制作用。 （3）發(fā)明了一種雙孢蘑菇高產(chǎn)栽培覆土技術(shù)研究 應(yīng)用蛭石替代傳統(tǒng)的覆土材料，在蛭石中添加2%的ACC脫氨酶產(chǎn)生菌惡臭假單胞菌菌劑，使用簡便，用工少，出菇提早，出菇集中，無病蟲害污染，產(chǎn)量高。與傳統(tǒng)覆土相比，增產(chǎn)35%以上。將覆土滅菌后添加2%的惡臭假單胞菌菌劑，與傳統(tǒng)覆土相比，增產(chǎn)13%。 （4）發(fā)現(xiàn)ACC是一種細菌趨化物質(zhì) 電鏡觀察ACC脫氨酶產(chǎn)生菌惡臭假單胞菌能夠吸附于雙孢蘑菇菌絲表面，且吸附量隨著菌絲ACC合成量的減少而減少，惡臭假單胞菌ACC脫氨酶基因敲除菌株則不能趨向吸附于菌絲表面。趨化實驗發(fā)現(xiàn)，ACC能同其他趨化物質(zhì)一樣，引起惡臭假單胞菌的趨化反應(yīng)，引起部分趨化基因上調(diào)，其中cheY上調(diào)表達1.23倍。ACC脫氨酶基因敲除菌株對ACC無趨化現(xiàn)象。所以，ACC是一種趨化物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)惡臭假單胞菌趨向于雙胞蘑菇菌絲表面發(fā)揮作用。 （5）發(fā)明了脂質(zhì)體介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化雙孢蘑菇菌褶新方法 應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化雙孢蘑菇的菌褶組織，與常用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化雙孢蘑菇菌褶方法相比，操作簡便，轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定。用該法構(gòu)建的雙孢蘑菇1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶基因（ACO）RNAi突變株，ACO基因表達量比出發(fā)菌株降低47%-74%，ACO酶活力降低68%-86%，乙烯產(chǎn)量降低27%-48%。該方法為雙孢蘑菇的遺傳改良提供了一個有效的分子生物學(xué)方法。 （6）建立了一種快速簡便直接檢測微量ACC的方法 測定ACC含量的方法有多種，可分為間接法和直接法二類。間接法將 ACC轉(zhuǎn)化為乙烯或是將 ACC衍生化后，再用氣相色譜儀、毛細管電泳、液相色譜與氣相色譜聯(lián)用等進行測定。直接檢測 ACC的方法有毛細管電泳和高效液相色譜-電噴霧/串聯(lián)質(zhì)譜等。間接法測定 ACC的結(jié)果往往偏低，而直接法所用的提取方法繁瑣、樣品需用量大，不便于大量樣品的同時測定或設(shè)備復(fù)雜。本研究探索了可以直接測定雙孢蘑菇培養(yǎng)料中微量 ACC含量的方法。建立了一種快速簡便直接檢測雙孢蘑菇培養(yǎng)料中微量1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)含量的離子色譜法。該方法樣品用量少，前處理簡便，雜質(zhì)干擾小，適用于食用菌和土壤微生物的研究。